미생물학과, 환경생활공학, 환경과학 등 환경미생물학 요점 정리 6. 분자생물학적 미생물 군집구조 분석법

제6장 분자생물학적 미생물 군집구조 분석법

 

6.1 개론

 

•환경미생물의 군집구조 분석을 위한 종래의 기술: 현미경 관찰, 배양을 통해 미생물 판별

 

•현미경 관찰의 한계

- 진핵 및 원핵 미생물은 고등 생물과는 달리 그 형태가 다양하지 않아 현미경으로 관찰되는 형태만으로는 미생물의 종류를 판별하기에 어려움이 따름

 

•배양을 통한 미생물 판별의 한계

- 환경계의 미생물 군집구조를 대변하기에는 무리가 있음 (이유 : 배지 종류에 따라 나타나는 미생물이 다를 수 있고, 배양 가능한 미생물은 전체 미생물의 0.1∼10%에 불가하기 때문)

- 시간과 비용을 많이 소모

- 미생물이 여러 세대를 거쳐 자라면서 그 형태와 반응 특성이 달라질 수 있음

 

•분자생물학적 미생물 군집구조 분석법

- 핵산의 추출과 DNA 증폭을 거치는 방법: Sequencing, T-RFLP, DGGE, Microarray

- FISH

 

•분자생물학적 미생물 군집구조 분석법의 특징

- 환경 시료의 미생물을 빠르게 확인가능

- 실제 미생물 군집구조에 가까운 대변하는 정보를 제공

 

 

 

6.2 분석대상

 

1. 16S 혹은 18S rRNA 유전자

 

•현재는 16S rRNA 유전자를 분석하여 미생물을 동정하고 군집구조를 분석하는 것은 환경 미생물학의 일반적인 영역이 되어가고 있음

 

 

6.3 PCR 기반 분석법

 

1. 중합효소연쇄반응(PCR)

 

•중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)

- DNA의 이중나선을 연속적으로 분리시켜 단일가닥으로 만든 후 그 단일가닥을 새로운 이중나선의 원본으로 사용하기 위하여 열에 안정한 DNA 중합효소로 가열 및 냉각을 반복하는 것

 

•PCR 증폭

- ‘열변성-결합-확장’이라는 한 사이클에 의해 DNA는 2배가 되며, 이것을 수십 회 반복하면 약 1시간에 DNA는 수백만 배로 증가

 

 

2. Sequencing과 계통분류학적 분석

 

•Sequencing : PCR을 통해 증폭된 16S rRNA 유전자 및 기능성 유전자의 염기서열을 분석하는 것

 

•Sequencing과 계통분류학적 분석의 의의 및 단점과 한계

- 의의 : 가장 정밀한 정보를 제공해 주는 장점이 있어 환경 미생물을 종(Species) 단계에서 정확히 판단하고자 할 때 널리 쓰이고 있음

- 단점 : 다른 분자생물학적 분석법들에 비해 시간과 비용이 많이 소모되므로 여러 시료를 동시에 분석하기 힘듦

- 한계 : 염기서열 분석은 정성분석에 치중되어 있어 정량분석에 한계가 있음

 

 

3. Real-time qPCR

 

•Real-time qPCR : 중합효소(polymerase)와 특이적 프라이머(primer, 분리된 단일가닥에 추가되는 짧은 DNA)를 이용하여 반복되는 온도조건을 통해 DNA를 기하급수적으로 증폭하는 PCR의 원리를 그대로 이용하는 기법

- 장점 : 목표 미생물을 정확하게 정량하는 획기적인 방법을 제공

- 단점 : 정량 정보만으로는 미생물 판별에 한계가 있으므로, sequencing과 같은 정성분석과 함께 적용될 때 더욱 의미 있는 결과를 도출할 수 있음

 

4. T-RFLP

 

•T-RFLP(Terminal Restriction Length Polymorphism) : 프라이머에 형광물질을 결합하여 목표 유전자를 증폭하고, 제한효소에 의해 절단되어 생성되는 말단절편 유전자의 다양성을 분석하는 방법

- 장점 : 여러 샘플을 한번에 분석할 수 있기 때문에 비용효율적인 방법을 제공

- 단점 : 미생물 군집구조 분석의 정밀도가 낮으므로 미생물의 정확한 판별이 힘들고, 미생물 군집구조가 너무 다양한 시스템에서는 상당히 복잡한 양상의 말단절편들이 생성되므로 해석이 곤란할 때도 있음

 

 

5. PCR-DGGE

 

•Denaturing Gradient Gel Electrophoresis(DGGE) : DNA에 나타나는 염기서열의 차이를 판별하는 방법으로써, 유전자에 포함된 구아닌과 시토신의 함율에 따라 다르게 변성되는 특성을 이용

- 장점 : 전기영동 상에서 갑자기 나타나거나 줄어드는 밴드로서 환경변화에 따른 군집구조를 판단하기에 용이하며, 의미있는 밴드는 분리 정제하여 선택적으로 sequencing 분석을 진행할 수 있음

- 단점 : 그러나 전기영동 젤(gel)을 만드는 것과 최적 변성제 농도경사를 결정하는 과정이 번거롭고 미생물의 군집구조가 너무 다양하면 분석하기가 어려우며, 또한 증폭되는 유전자의 길이가 한정되어 있어 sequencing으로 확인되는 정보가 제한적

 

 

6. DNA 마이크로어레이

 

•DNA microarray : 고체 기판에 탐침자(probe)인 다중 뉴클레오티드를 배열하여 고정시킨 것으로써, 탐침자에 상보적인 DNA가 결합되면 이것을 탐지하여 미생물의 군집구조를 확인하는 방법

- 장점 : 고도로 집적화된 탐침자를 제공하므로, 한번에 여러 유전자의 존재 유무와 발현정도를 빠른 시간 안에 분석

- 단점 : DNA 탐침자 설계에 많은 시간과 노력이 소모되며, 어레이 제작이 비쌈

 

 

7. FISH법

 

•FISH(Fluorescence In-Situ Hybridization) : 생체활동이 정지되도록 미생물을 고정시키고 환경미생물의 DNA 또는 RNA에 형광 탐침자가 결합되도록 하여 형광발현 미생물을 형광현미경 및 유세포분석기를 통해 확인하는 방법

- 의의 : 넓은 부류의 미생물군과 좁은 부류의 미생물군이 있을 때 그 비율을 계산하기 위해 활용될 수 있음

- 장점 : 환경 시료에서 목적 미생물의 공간적 위치에 대한 정보를 얻을 수 있다는 점과 미생물 분리에 사용될 수 있다는 점(형광발현을 통해 확인된 미생물은 유세포분석기를 통해 분리)

 

 

 

6.4 미생물 연료전지

 

•연료전지: 전기화학적 반응을 통하여 화학에너지를 직접 전기에너지로 변환시킬 수 있는 가장 환경친화적인 일종의 발전장치

 

•미생물 연료전지: 화학연료전지와는 달리 미생물 균체를 생촉매로 사용하여 직접 전기에너지를 발생시키는 기술

 

•미생물 연료전지의 종류

- 매개체형 미생물 연료전지: 혐기성 미생물과 음극 사이에서의 전자전달 시 매개체(mediator)를 사용하는 경우

- 무매개체형 미생물 연료전지: 매개체(mediator) 없이 미생물이 직접 전자를 전달하는 경우

 

•전기활성미생물의 종류 : Shewanella

연습문제

 

1. 분자생물학적 기술에 가장 많이 사용되는 유전자는?

① 5S rRNA ② 15S rRNA

③ 16S rRNA ④ 23S rRNA

 

[정답] 3

 

현재는 16S rRNA 유전자를 분석하여 미생물을 동정하고 군집구조를 분석하는 것은 환경 미생물학의 일반적인 영역이 되어가고 있다. 즉, 여러 데이터베이스 및 생물정보학적 도구들은 현재까지 밝혀진 16S rRNA 유전자를 모아 환경 미생물학자들의 군집구조 분석을 돕고 있다.

 

 

2. PCR 증폭의 한 사이클은?

① 열변성-결합-확장

② 열변성-확장-결합

③ 결합-확장-열변성

④ 확장-결합-열변성

 

[정답] 1

 

PCR 증폭의 한 사이클은 다음과 같다.

- 열변성: 우선 두 가닥의 DNA에 열을 가하여 2개의 단일가닥으로 나눔

- 결합: 단일가닥에 프라이머(primer)라고 하는 짧은 DNA를 추가하여 냉각하면 프라이머가 DNA에 결합

- 확장: 이것에 DNA 폴리머라아제(Polymerase)라는 효소를 더하면 프라이머 부분이 출발점이 되어 DNA가 복제

→ 이 '가열 및 냉각'이라고 하는 1사이클로 DNA는 2배가 되며, 이것을 수십 회 반복하면 약 1시간에 DNA는 수백만 배로 증폭

 

 

3. 가장 정밀한 정보를 제공해 주는 장점이 있어 환경 미생물을 종(Species) 단계에서 정확히 판단하고자 할 때 널리 쓰이고 있지만, 염기서열 분석은 정성분석에 치중되어 있어 정량분석에 한계가 있는 것은?

① PCR-DGGE ② FISH

③ DNA 마이크로어레이 ④ Sequencing과 계통분류학적 분석

 

[정답] 4

 

Sequencing은 PCR을 통해 증폭된 16S rRNA 유전자 및 기능성 유전자의 염기서열을 분석하는 것으로, Sequencing과 계통분류학적 분석은 가장 정밀한 정보를 제공해 주는 장점이 있어 환경 미생물을 종(Species) 단계에서 정확히 판단하고자 할 때 널리 쓰이고 있다. 하지만 다른 분자생물학적 분석법들에 비해 시간과 비용이 많이 소모되므로 여러 시료를 동시에 분석하기 힘들고, 염기서열 분석은 정성분석에 치중되어 있어 정량분석에 한계가 있다.

 

 

4. 목표 미생물을 정확하게 정량하는 획기적인 방법을 제공하지만, 정량정보만으로는 미생물 판별에 한계가 있어 sequencing과 같은 정성분석과 함께 적용될 때 더욱 의미 있는 결과를 도출하는 것은?

① DNA microarray ② FISH

③ Real-time qPCR ④ T-RFLP

 

[정답] 3

 

Real-time qPCR은 중합효소(polymerase)와 특이적 프라이머(primer, 분리된 단일가닥에 추가되는 짧은 DNA)를 이용하여 반복되는 온도조건을 통해 DNA를 기하급수적으로 증폭하는 PCR의 원리를 그대로 이용하는 기법이다. 목표 미생물을 정확하게 정량하는 획기적인 방법을 제공하지만, 정량 정보만으로는 미생물 판별에 한계가 있으므로 sequencing과 같은 정성분석과 함께 적용될 때 더욱 의미 있는 결과를 도출할 수 있다.

 

 

5. 여러 샘플을 한번에 분석할 수 있기 때문에 비용효율적인 방법을 제공해 주지만, 미생물 군집구조 분석의 정밀도가 낮아 미생물의 정확한 판별이 힘들고 미생물 군집구조가 너무 다양한 시스템에서는 해석이 곤란할 때도 있는 것은?

① DNA microarray ② FISH

③ Real-time qPCR ④ T-RFLP

 

[정답] 4

 

T-RFLP(Terminal Restriction Length Polymorphism)는 프라이머에 형광물질을 결합하여 목표 유전자를 증폭하고, 제한효소에 의해 절단되어 생성되는 말단절편 유전자의 다양성을 분석하는 방법이다. 여러 샘플을 한번에 분석할 수 있기 때문에 비용효율적인 방법을 제공하지만, 미생물 군집구조 분석의 정밀도가 낮으므로 미생물의 정확한 판별이 힘들고 또한 미생물 군집구조가 너무 다양한 시스템에서는 상당히 복잡한 양상의 말단절편들이 생성되므로 해석이 곤란할 때도 있다.

 

 

6. 유전자에 포함된 구아닌과 시토신의 함율에 따라 다르게 변성되는 특성을 이용한 것으로, 환경변화에 따른 군집구조를 판단하기에 용이하며 또한 의미있는 밴드는 분리 정제하여 선택적으로 sequencing 분석을 진행할 수 있는 것은?

① DNA microarray ② T-RFLP

③ PCR-DGGE ④ FISH

 

[정답] 3

 

PCR-DGGE는 DNA에 나타나는 염기서열의 차이를 판별하는 방법으로써, 유전자에 포함된 구아닌과 시토신의 함율에 따라 다르게 변성되는 특성을 이용한 것이다. 전기영동 상에서 갑자기 나타나거나 줄어드는 밴드로서 환경변화에 따른 군집구조를 판단하기에 용이하며, 의미있는 밴드는 분리 정제하여 선택적으로 sequencing 분석을 진행할 수 있다. 그러나 전기영동 젤(gel)을 만드는 것과 최적 변성제 농도경사를 결정하는 과정이 번거롭고 미생물의 군집구조가 너무 다양하면 분석하기가 어려우며, 또한 증폭되는 유전자의 길이가 한정되어 있어 sequencing으로 확인되는 정보가 제한적이다.

 

 

7. 고체 기판에 탐침자인 다중 뉴클레오티드를 배열하여 고정시킨 것으로써, 탐침자에 상보적인 DNA가 결합되면 이것을 탐지하여 미생물의 군집구조를 확인하는 방법은? 1

① DNA microarray ② FISH

③ Real-time qPCR ④ T-RFLP

 

[정답] 1

 

DNA microarray는 고체 기판에 탐침자(probe)인 다중 뉴클레오티드를 배열하여 고정시킨 것으로써, 탐침자에 상보적인 DNA가 결합되면 이것을 탐지하여 미생물의 군집구조를 확인하는 방법이다. 고도로 집적화된 탐침자를 제공하므로, 한번에 여러 유전자의 존재 유무와 발현정도를 빠른 시간 안에 분석할 수 있지만, DNA 탐침자 설계에 많은 시간과 노력이 소모되며 어레이 제작이 비싸다.

 

 

8. 분자생물학적 미생물 군집구조 분석법 중에서 형광 탐침자를 이용하는 현미경 관찰법으로 환경시료를 직접적으로 시각화하는 방법은?

① DNA microarray ② FISH

③ Real-time qPCR ④ T-RFLP

 

[정답] 2

 

FISH(Fluorescence In-Situ Hybridization)는 생체활동이 정지되도록 미생물을 고정시키고 환경미생물의 DNA 또는 RNA에 형광 탐침자가 결합되도록 하여 형광발현 미생물을 형광현미경 및 유세포분석기를 통해 확인하는 방법이다. 넓은 부류의 미생물군과 좁은 부류의 미생물군이 있을 때 그 비율을 계산하기 위해 활용될 수 있으며, 환경 시료에서 목적 미생물의 공간적 위치에 대한 정보를 얻을 수 있다는 점과 미생물 분리에 사용될 수 있다는 점이다(형광발현을 통해 확인된 미생물은 유세포분석기를 통해 분리할 수 있다).

 

 

9. 미생물 연료전지와 관계있는 미생물은?

① Zooglea ② Pseudomonas

③ Sphaerotilus ④ Shewanella

 

[정답] 4

 

미생물 연료전지는 화학연료전지와는 달리 미생물 균체를 생촉매로 사용하여 직접 전기에너지를 발생시키는 기술이며, 미생물 연료전지에 관계있는 미생물에는 대표적으로 Shewanella가 있다.